Il sistema CRISPR dai formaggi alla medicina di domani

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No, non parliamo di eccellenze Italiane, come il parmigiano o moda Milanese. Parliamo di come la recente scoperta di un sistema immunitario adattativo nei batteri, già di per sè inaspettata, stia rivoluzionando la manipolazioni di geni, con importanti implicazioni per la medicina di domani. Questa storia, utile anche a illustrare come il progresso scientifico e lo sviluppo tecnologico e industriale procedano per vie non sempre lineari - ma di sicuro inaspettate e interessanti - comincia così: C’era una volta, poco tempo fa, Danisco, un’industria alimentare danese, interessata a migliorare la produzione casearia. I batteri sono pur sempre i piccoli schiavi invisibili che ‘lavorano’ alla produzione di formaggi e yogurt. Alla Danisco nel 2005 si erano accorti che i batteri che impiegavano erano meno resistenti ai loro predatori, i virus batteriofagi, in mancanza di pezzetti di sequenze ripetute nel DNA genomico dei batteri.
La cosa interessante è che i pezzetti in questione erano identici a pezzi del DNA dei loro predatori.
Quelli della Danisco ipotizzarono che i curiosi pezzetti, che chiamarono CRISPR, per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, fossero parte di un sistema di difesa dei batteri.

Come funzioni questo sistema l’hanno compreso numerose ricerche successive. In pratica, i batteri hanno sviluppato un modo per rispondere alle infezioni di un determinato virus batteriofago immagazzinandone parte del DNA nel proprio genoma, a memoria di un’avvenuta infezione. In questo modo, i pezzetti del codice genetico virale possono venire tramandati e trasmessi alla popolazione di batteri e, seguendo una logica simile al nostro sistema immunitario adattativo, questi possono usare i pezzetti per sconfiggere una nuova infezione da parte dello stesso virus. I dettagli del sistema rivelano un piccolo capolavoro evolutivo. Infatti, i pezzetti dei virus inglobati nel DNA batterico vengono trascritti come normali RNA, ma vengono intercettati da un enzima chiamato Cas9, che li usa come guida per riconoscere il DNA dell’invasore. L’enzima in sè è una forbice molecolare che taglia entrambe le eliche del DNA, facendo quindi letteralmente a fette specificatamente il DNA del virus. Fine dell’infezione e tutti contenti, a partire da quelli della Danisco che ora usano queste conoscenze per scoprire a che virus sono suscettibili i loro batteri caseari (semplice: quelli di cui non hanno ancora inglobato le sequenze), e per ingegnerizzare la resistenza a nuovi virus, senza che necessariamente i loro batteri si ammalino.

Ma cosa c’entra lo sviluppo biotecnologico caseario con la ricerca di oggi e la medicina di domani? Qui la storia prende una piega inaspettata e si sposta a Berkeley, in California, nel laboratorio di Jennifer Doudna che, nonostante il DNA nel nome, studia la struttura di RNA e proteine. Qui, Martin Jinek, proveniente dalla repubblica ceca, passando per studi universitari in UK, e fresco di dottorato in cristallografia delle proteine all’EMBL di Heidelberg in Germania, comincia a studiare la struttura e il funzionamento di Cas9.
Al sole della California, e con l’aiuto del laboratorio di Emmanuelle Charpentier dell’universita’ di Umea in Svezia, scopre i dettagli molecolari con cui Cas9, in associazione con RNA complementare al DNA del virus, lo riconosce e lo taglia. Cas9 e l’RNA formano un ribozima, un’antica invenzione che e alla base della vita - i ribosomi, che permettono la sintesi di proteine in ogni cellula, sono ribozimi. Diventa chiaro che il ribozima puo’ funzionare con qualunque sequenza guida a RNA che segua poche semplici regole. Da qui a dimostrare che Cas9 taglia qualunque sequenza di DNA in modo preciso ed efficiente, se armato dell’RNA complementare corrispondente il passo e’ breve. E ancora meno a capire che il sistema costituisca l’equivalente di una microscopica forbice molecolare specifica per manipolare in DNA a piacere. Infatti, si scopre che in cellule eucariotiche, come le nostre, i tagli vengono riparati in modo imperfetto, creando frequentemente microinserzioni o delezioni, ovvero l’aggiunta o la cancellazione di alcune basi del DNA nella regione riconosciuta, la condizione perfetta per modificare geni  direttamente dove risiedono nel genoma. Siamo ad oggi, e gli usi tecnologici e industriali non tardano ad arrivare. Jinek, ora professore a Zurigo, Doudna e altri fondano Caribou Bioscences per sviluppare tecnologie per l’ingegnerizzazione del DNA basate su Cas9) e molti altri seguono. Parte la corsa allo sfruttamento della tecnologia, e gia’ da qualche mese non passa settimana che non riceva e-mail di ditte che propongono servizi di inattivazione dei geni che studiamo in laboratorio.

Al di là della storia che ho raccontato, quali sono le origini, le prospettive e le implicazioni della scoperta di CRISPR e Cas9? La scoperta è figlia dei tempi, come spesso in biologia. Doudna e molti altri hanno studiato negli ultimi anni un sistema simile, quello dell’interferenza a RNA, che nelle cellule eucariotiche ci difende dai virus e regola l’espressione di molti geni. Questo sistema, che riduce la quantità di un RNA, degradandolo, è stato parte anch’esso di una rivoluzione in biologia negli ultimi dieci anni, che di per se’ promette progressi impensabili nella diagnostica e nella medicina. L’interferenza a RNA viene ora anche universalmente nei laboratori di ricerca come strumento per attenuare la funzione di geni a piacere. La differenza, rispetto a CRISPR/Cas9, e’ che non permette lo spegnimento totale e trasmissibile di geni (come avviene mutandoli). La scoperta di entrambi i sistemi a sua volta si deve in parte alle conoscenze ottenute dai progetti di sequenziamento dei genomi iniziati una quindicina di anni fa, perché entrambi si basano sulla complementarietà di sequenza tra acidi nucleici. In più, beneficia dei progressi nella nostra comprensione dei sistemi di riparo del DNA. Infine, lo sfruttamento di CRISPR/Cas9 come forbice molecolare per modificare il DNA segue precedenti esperienze con nucleasi Zinc-finger e Transcription Activator-Like Effector Nuclease, per gli amici TALEN, due tipi di enzimi a loro volta capaci di tagliare il DNA in modo specifico. Questi però non usano guide a RNA, che possono essere prodotte e montate su un invariante Cas9 facilmente, e richiedono la costruzione di un enzima dedicato per ogni modifica.
Non sono tutte rose e fiori: non sappiamo ancora quanto preciso e affidabile sia Cas9. Se lo usassimo in futuro per modificare il DNA di un malato (Immaginatevi di spegnere un oncogene), provocheremmo anche altre modifiche nel suo genoma? Questo è possibile, se non altro perchè le sequenze guida sono piuttosto corte e non sempre sono uniche in un genoma. Non sappiamo ancora bene cosa succede durante la riparazione del DNA tagliato da Cas9 e qual è l’esatto spettro di modifiche che ciò implica. In più riparare il DNA tagliato su entrambi i filamenti della doppia elica è un affare notoriamente complesso e rischioso, tanto è vero che la riparazione del DNA è uno dei sistemi che vengono quasi universalmente disabilitati dai tumori. C’è qualche evidenza che fornendo due RNA guida in zone limitrofe si possa cancellare l’intera regione di DNA compresa. Inoltre introducendo oltre a guide a RNA ad hoc anche un DNA stampo, Cas9 può anche correggere sequenze a piacere, non solo cancellare o aggiungere basi a caso. Infine, disegnando più di una guida per riconoscere regioni sufficientemente distanti, si può produrre mutazioni in più geni contemporaneamente. L’introduzione o la cancellazione di più sequenze in modo simultaneo e controllato promette di aumentare enormemente la flessibilità’ del sistema, permettendo di ridisegnare geni a piacere in modo preciso. Però non è ancora del tutto dimostrato quanto realizzabili, efficienti e fedeli siano queste variazioni sul tema. Nonostante ciò, volendo essere ottimisti e visionari, come per deformazione professionale lo sono gli scienziati, bisogna notare come la scoperta di CRISPR/Cas9 stia già rivoluzionando la scienza in laboratorio. Per ora sembra che Cas9 e le sequenze guida possano essere introdotte in qualunque cellula di qualunque organismo. Ciò ha già permesso di modificare organismi modello impermeabili ad altri sistemi, sviluppare sistemi di screening innovativi in cellule in coltura e di velocizzare enormemente la costruzione di organismi modello complessi per svariate malattie.

Non si vede come nel medio-lungo periodo queste scoperte non debbano maturare una miriade di applicazioni tecnologiche da adottare con le dovute cautele anche per medicina del futuro.
Parafrasando il “Gene Egoista” di Dawkins, in fondo i nostri geni determinano come siamo e per quanto lo siamo. Non avere limiti sul loro design, in tempi di medicina personalizzata e di genomi a 100 dollari, implica un mondo di possibilità, che vanno dalla correzione di difetti genetici congeniti o acquisiti, fino al ringiovanimento. Sky is the limit, come direbbero i nostri amici di oltreoceano. In sostanza, un taglia e cuci di altissima sartoria ci sta introducendo nell’era della microchirurgia del DNA, che promette di renderci più sani e longevi, dal di dentro.

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